Постановка реакции преципитации в геле. Реакция преципитации

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора Аг (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых коли­чествах, которые не обнаруживаются химическим путем.

Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические час­тицы белково–ПС прир: экстракты из мкÒ, органов и тк, пат материала; продукты распада бакте­риальной клетки, их лизаты, фильтраты. Преципитиногены обладают термоустойчивостью, поэтому для их получения материал подвергается кипячению. В РП используются жидкие прозрачные Аг.

Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Постановка РП Асколи. В узкую пробирку с небольшим кол-вом неразведенной преципитирующей сыворотки, держа ее в наклонном положении, пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем Аг. Чтобы не смешать две жидкости, пробирку осторожно ставят вертикаль­но. При положительной реакции в пробирке на границе между сыворот­кой и исследуемым экстрактом через 5–10 мин появля­ется серовато–белое кольцо. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Реакция Асколи применяется для идентификации сибиреязвенного, туляремийного, чумного Аг. Она нашла также применение в су­дебной медицине для опред-я видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фаль­сификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Не­достатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав Аг, участвующих в формиро­вании преципитата.

Реакция преципитации Оухтерлони. Реакцию ставят на чашках Петри в лунках агарового геля. В качестве геля используют хорошо отмытый прозрачный агар. Аг и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном рассто­янии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют через 24–48 ч иммунный комплекс в виде белой полосы. При наличии сложного по составу преципитиногена возникает несколько полос. При этом полосы серологически родственных антигенов сливаются воедино, а полосы разнородных пере­крещиваются, что позволяет определить детали антигенной структуры исследуемых веществ. Широко используется для диагностики заболева­ний, вызываемых вирусами и бактериями, продуцирующими экзотоксины.

3.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнару­жения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обыч­ных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчай­шим микроорганизмам.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабаты­вают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритро­цитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.

Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пу­говицы»

ПРЕЦИПИТАЦИЯ (лат. praecipitatio стремительное падение) - иммунологическая реакция осаждения из раствора комплекса антиген-антитело, образующегося в результате соединения растворимого антигена (преципитиногена) со специфическими антителами (преципитинами).

Реакцию П. широко используют для идентификации и количественного определения самых разнообразных антигенов и антител (см. Иммунодиагностика), при серодиагностике инф. болезней (см. Серологические исследования), для обнаружения примесей в пищевых продуктах, при изучении эволюционных взаимосвязей в животном и растительном мире, при исследовании структуры различных биол, соединений, в судебной медицине для определения видовой принадлежности пятен крови и других биол, жидкостей.

П. открыта в 1897 т. Краусом (R. Kraus), наблюдавшим выпадение осадка (преципитата) при смешивании бесклеточных прозрачных фильтратов бульонных культур бактерий чумы, холеры, тифа с гомологичными иммунными сыворотками. В 1899 г. Ф. Я. Чистович, иммунизируя кроликов сывороткой угря, получил преципитирующие антитела и тем самым впервые продемонстрировал видовую специфичность белков сыворотки крови. Применение П. в суд.-мед. экспертизе для определения видовой принадлежности крови было предложено в 1901 г. П. Уленгутом. Реакция получила название реакции Чистовича - Уленгута. Впоследствии было показано, что преципитирующие антитела (см.) образуются у представителей различных видов позвоночных к любым чужеродным высокомолекулярным веществам (см. Антигены ). Преципитирующие антитела принадлежат к иммуноглобулинам класов G и M (см. Иммуноглобулины). Скорость и интенсивность биосинтеза преципитирующих антител определяются рядом факторов: дозой и путем введения антигена, схемой иммунизации, особенностями хим. структуры антигена и генетическими особенностями иммунизируемого организма.

Для получения преципитирующих сывороток используют различные схемы иммунизации. Хорошие результаты дают схемы из нескольких циклов иммунизации, каждый из которых включает несколько внутривенных или внутримышечных инъекций антигена в возрастающих количествах. В 1915 г. М. И. Райский предложил схему, состоящую из первичной иммунизации и отдаленной реиммунизации. На этом принципе основано получение преципитирующих сывороток высокого титра. Первичную иммунизацию принято проводить антигеном в смеси с каким-либо депонирующим веществом (ланолином, минеральным маслом, алюмокалиевыми квасцами и др.), усиливающим иммунный ответ, а отдаленную реиммунизацию - только антигеном. Широко применяют в качестве депонирующего вещества адъювант (усилитель) Фрейнда, состоящий из смеси минеральных масел и убитых микобактерий туберкулеза (см. Адъюванты).

Раствор антигена, эмульгированный в равном объеме адъюванта Фрейнда, вводят экспериментальным животным подкожно или внутримышечно в несколько точек спины либо в подушечки задних лапок или в подколенные лимф. узлы задних конечностей. В некоторых схемах используют комбинации перечисленных способов введения. Через месяц животным вводят р-р антигена внутривенно или внутримышечно. При необходимости перед реиммунизацией проводят гипосенсибилизацию по Безредке (см. Безредки методы). При незначительном расходе антигена (1-3 мг для белковых антигенов на курс иммунизации) количество образующихся антител достигает нескольких миллиграммов в 1 мл иммунной сыворотки.

Для реакции преципитации характерна высокая специфичность. В серии работ К. Ландштейнера с антисыворотками к конъюгированным антигенам, в качестве детерминантных групп которых выступали различные органические радикалы, было продемонстрировано, что в реакции П. можно дифференцировать стереоизомеры органических соединений. Сила наблюдающихся перекрестных реакций определяется близостью хим. структуры детерминантных групп иммуноантигенов и тест-антигенов. В состав преципитата входят антигены и специфичные к ним антитела и практически не включаются другие белки сыворотки крови, кроме комплемента.

П.- высокочувствительная реакция. С ее помощью могут быть обнаружены десятые доли микрограмма антигена. При определении антител порог чувствительности реакции составляет ок. 20 мкг белка. Чувствительность реакции значительно повышается, если применяют антигены или антитела, меченные радиоактивными изотопами (см.).

Постановка реакции

При постановке реакции преципитации необходимо учитывать ее зональный характер, который выражается в том, что молекулярный состав и количество образующегося преципитата определяются соотношением введенных в реакцию антигена и антител (см. Антиген - антитело реакция). При использовании постоянного количества антисыворотки и возрастающих количеств антигена количество преципитата в ряду пробирок вначале увеличивается, достигает максимума, а затем уменьшается вплоть до полного исчезновения. В надосадочной жидкости первых пробирок обнаруживают свободные антитела (зона избытка антител), в жидкости над максимальным преципитатом не содержатся ни свободные антитела, ни свободный антиген (зона эквивалентности), в надосадочной жидкости последних пробирок находят растворимые иммунные комплексы и свободный антиген (зона избытка антигена). Образование растворимых иммунных комплексов с небольшим молекулярным весом в зоне избытка антигена характерно для всех преципитирующих систем, антитела в которых принадлежат к IgG. Эта зона реакции названа поэтому зоной задержки, или постзоной. Следует отметить, что иммунные комплексы антигенов с IgM-антителами нерастворимы в очень большом избытке антигена, в десятки раз превышающем его количество, достаточное для образования растворимых иммунных комплексов с IgG-антителами.

Для лошадиных противобелковых сывороток характерно образование растворимых иммунных комплексов и в зоне избытка антител, т. е. образование прозоны (см. Нейссера-Вексберга феномен). Эту особенность реакции впервые обнаружил Г. Рамон в системе дифтерийный токсин - антитоксическая лошадиная сыворотка (см. Флоккуляция). Растворение иммунных комплексов в зоне избытка антител наблюдали впоследствии при проведении П. с кроличьими и собачьими сыворотками крови против бычьего сывороточного альбумина, с человеческой сывороткой крови против тиреоглобулина, овечьей антисывороткой против синтетических полипептидов.

Молекулярный состав преципитата определяется также мол. весом (массой) антигена. Для яичного альбумина, мол. вес к-рого 42 000 дальтон, в зоне эквивалентности на одну молекулу антигена приходится в среднем 2,5 молекулы антител. С увеличением мол. веса антигена число молекул антител, связываемых одной молекулой антигена, увеличивается.

П. используют для качественного и количественного определения антигенов и антител. Быстрый, простой и чувствительный качественный метод П.- кольцепреципитация, предложенная в 1902 г. Асколи. Кольцепреципитацию применяют для идентификации растворимых антигенов микроорганизмов. Реакцию выполняют в узких пробирках или капиллярах, осторожно наслаивая р-р антигена на иммунную сыворотку. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется кольцо преципитации. На результат реакции не влияет избыток антигена благодаря постепенной диффузии реагентов к границе жидкостей. Если в качестве антигенов используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то реакция носит название «термопреципитация» (см. Асколи реакция). С помощью термопреципитации обнаруживают термостабильные бактериальные антигены (коктоантигены) в тканях и органах погибших животных при диагностике чумы, холеры, сибирской язвы. Кольцепреципитацию и термопреципитацию выполняют с антисыворотками высокого титра.

К полуколичественным методам П. могут быть отнесены методы оценки силы сывороток и количества антигенов по их предельному разведению, дающему еще видимую П. со стандартным антигеном или анти-сывороткой, и методы оптимальных пропорций.

При титровании сывороток по предельному разведению необходимо подбирать такое количество антигена, чтобы не попасть в зону задержки. Поэтому предварительно определяют наименьшее разведение тест-антигена, при к-ром происходит реакция с заведомо положительной сывороткой. Это рабочее разведение (дозу) антигена используют для определения предельного разведения (титра) испытуемых сывороток. Сравнительное титрование антигена методом предельных разведений можно проводить без предварительного подбора рабочей дозы сыворотки, если она содержит антитела преципитирующего, но не флоккулирующего типа.

Метод оптимальных пропорций основан на определении точки эквивалентности серол. системы по инициальной И. и на том наблюдении, что точка эквивалентности в каждой серол. системе возникает при определенном отношении антитела к антигену. Поэтому при титровании сывороток, определив по быстроте П. количество стандартного антигена, соответствующее точке эквивалентности, можно выразить ее активность в любых условных биол. единицах, если в предварительном титровании с сывороткой известной силы установлено, скольким ее единицам эквивалентен стандартный антиген. Аналогичные расчеты проводят при титровании антигена со стандартной сывороткой. Метод оптимальных пропорций может быть выполнен в a-варианте, предложенном Дином и Уэббом (H. Dean, R. Webb, 1928),- с постоянным объемом сыворотки и возрастающими разведениями антигена и в ß-варианте, предложенном Г. Рамоном (1922),- с постоянным объемом антигена и возрастающими разведениями сыворотки.

Количественный метод определения антител в весовых единицах, предложенный в 1933 г. Гейдельбергером (М. Heidelberger) и Кендаллом (F. Е. Kendall), основан на том, что в зоне эквивалентности из раствора в осадок выпадают практически весь антиген и все антитела. Определив любым хим. методом количество белка преципитата в этой точке и вычтя из него количество прибавленного в пробу антигена, рассчитывают количество белка в осадке, приходящееся на долю антител.

При постановке П. любым из описанных методов следует работать с хорошо отцентрифугированными р-рами антигенов и сывороток. Реакция должна сопровождаться контролем: иммунная сыворотка + изотонический р-р хлорида натрия, нормальная сыворотка + антиген, гетерологическая сыворотка + антиген. Следует предотвращать возможность бактериального загрязнения, выполняя П. в стерильных условиях или применяя консерванты типа мертиолата, амида натрия. Реакцию выполняют при физиол. концентрации соли (0,15 М раствор хлорида натрия), в диапазоне pH 6,5-8,0.

Определение индивидуальных антигенов, находящихся в смеси с другими веществами, возможно в реакции П. только при использовании моноспецифических сывороток. Специфические антитела в сыворотках могут быть идентифицированы, если П. выполняют с индивидуальными антигенами. Для анализа, характеристики и сравнения многокомпонентных систем антиген - антитело без их предварительного фракционирования используют методы, основанные на проведении П. в геле, в частности метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню (см. Иммунодиффузия) .

П.- двухфазная реакция. Фазы реакции отличаются по механизму и скорости протекания (см. Антиген-антитело реакция). Следует учитывать, что на вторую фазу реакции - собственно образование преципитата - оказывает влияние ряд неспецифических факторов: концентрация в растворе солей и водородных ионов, температура, объем реагентов. При увеличении концентрации солей выше физиол, значения (0,15 М) количество образующегося преципитата уменьшается. В 15% р-ре хлорида натрия преципитаты, образованные полисахаридными антигенами, диссоциируют. Изменение концентрации водородных ионов в физиол. пределах pH (от 6,5 до 8,0) заметно не влияет на формирование преципитата. При снижении pH раствора до 5,0 или повышении до 9,0 существенно уменьшается количество образующегося преципитата, а при pH ниже 3,0 и выше 11,0 ранее образованные преципитаты диссоциируют. На свойстве преципитатов диссоциировать в крепких солевых р-рах и при крайних значениях pH основаны методы выделения чистых антител и антигенов из специфических преципитатов. Наиболее употребляемые диссоциирующие агенты - концентрированные р-ры нейтральных солей, разбавленные к-ты и щелочи, концентрированные р-ры амидов, полианионы.

Преципитация в судебно-медицинском отношении

В судебной медицине П. применяют для дифференцирования крови человека и животных (см. Кровь). Наибольшее распространение получила кольцепреципитация, но она не пригодна для исследования мутных р-ров антигена и подвержена неспецифическим влияниям загрязнений объекта экспертизы. Этих недостатков лишена П. в агаровом геле, однако она требует длительных сроков наблюдения и менее чувствительна. Внедряют в практику электропреципитацию, или встречный иммуноэлектрофорез (см.), сочетающий достоинства П. в агаре с высокой чувствительностью и быстротой проведения реакции. Все варианты П. осуществляют с иммунными сыворотками (см.), преципитирующими белки человека, собаки, лошади и др. Они должны быть активны и специфичны, т. е. вызывать П. гомологичного антигена (напр., соответствующей нормальной сыворотки крови человека пли животного) и не образовывать преципитата с гетерологичными (чужеродными) антигенами.

Из исследуемых пятен крови готовят вытяжки и разводят их до необходимой концентрации белка. Для П. в агаре можно брать вырезки (вытяжки) из пятен и проводить реакцию с несколькими преципитирующими сыворотками. Параллельно испытывают контрольные участки предмета - носителя пятен, которые не должны вызывать П. При положительном результате с пятном крови и преципитирующей сывороткой делают вывод о видовой принадлежности крови, напр. кровь человека, собаки и др. При этом нельзя точно установить происхождение крови, если она принадлежит близкородственным животным (напр., кровь собаки или волка). Отрицательный результат при наличии в вытяжке белка свидетельствует о принадлежности крови животному, белок к-рого не выявляется с помощью обычного набора преципитирующих сывороток. Если в вытяжке не установлен белок, то принимают во внимание лишь положительный результат, т. к. отсутствие преципитата можно объяснить недостаточным количеством белка в вытяжке.

Библиография: Бойд У. Основы иммунологии, пер. с англ., с. 314, М., 1969; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., с. 8 и др., М., 1968; Райски й М. Быстрое получение крепких преципитинов, Харьковск. мед. журн.,т. 20, № 8, с. 135, 1915; он же, Повторная иммунизация, как метод получения преципитирующих сывороток, там же, с. 142; он же, Как долго сохраняются в крови иммунизированного животного крепкие преципитины, там же, № 9, с. 161; он же, Как нужно иммунизировать, чтобы животное устойчиво и длительно сохраняло в крови крепкие преципитины, там же, с. 169; Туманов А. К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств^ с. 57,М., 1975; Чарный В. И. Установление видовой специфичности белков крови, М., 1976; Чистович Ф. Я. Изменения свойств крови при впрыскивании инородной сыворотки и крови, в связи с теорией иммунитета Ehrlich’a, Рус. арх. патол., клин, мед. и бакт., т. 8, в. 1, с. 21, 1899; С а г-р enter Ph. L. Immunology and serology, Philadelphia, 1975; Methods in immunology and immunochemistry, ed. by C. A. Williams a. M. W. Chase, v. 3, N. Y.- L., 1971.

И. А. Тарханова; В. И. Чарный (суд.).

Реакции антигенов с антителами называются серологическими или гуморальными, потому что участвующие в них специфические антитела всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции между антителами и антигенами, которые происходят в живом организме, могут быть воспроизведены в лабораторных условиях с диагностической целью.

Серологические реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX – начале ХХ века.

Использование реакций иммунитета с диагностической целью основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом.

Определение антигенной структуры микробов и их токсинов позволило разработать не только диагностикумы и лечебные сыворотки, но и сыворотки диагностические. Иммунные диагностические сыворотки получают путем иммунизации животных (например, кроликов). Эти сыворотки используют для идентификации микробов или экзотоксинов по антигенной структуре при помощи постановки серологических реакций (агглютинации, преципитации, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации и др.). Иммунные диагностические сыворотки, обработанные флюорохромом, используются для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний методом иммунной флюоресценции.

С помощью известных антигенов (диагностикумов) можно определять наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого (серологическая диагностика инфекционных заболеваний).

Наличие же специфических иммунных сывороток (диагностических) позволяет установить видовую, типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Внешнее проявление результатов серологических реакций зависит от условий ее постановки и физиологического состояния антигена.

Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, лизиса, связывания комплемента, иммобилизации.

Растворимые антигены дают феномен преципитации, нейтрализации.

В лабораторной практике с диагностической целью используют реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, связывания комплемента, торможения гемагглютинации и др.

Реакция агглютинации (РА)

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов.

У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).

Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.

Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.

Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.

РПГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.

В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.

Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).

В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.

Результаты РПГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.

Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).

При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.

Реакция преципитации (РП)

В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации (преципитиногеном) служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул.

Это могут быть белки, комплексы белков с липидами и углеводами, микробные экстракты, различные лизаты или фильтраты культур микробов.

Антитела, обуславливающие преципитирующее свойство иммунной сыворотки, называются преципитинами, а продукт реакции в виде осадка – преципитатом.

Преципитирующие сыворотки получают путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток.

Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.

Механизм реакции преципитации аналогичен механизму реакции агглютинации. Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. И в том, и в другом случае под влиянием иммунной сыворотки и электролитов наступает укрупнение взвешенных в жидкости частиц антигена (уменьшение степени дисперсности). Однако для реакции агглютинации антиген берется в виде гомогенной мутной микробной взвеси (суспензии), а для реакции преципитации – в виде прозрачного коллоидного раствора.

Реакция преципитации является высоко чувствительной и позволяет обнаруживать ничтожно малые количества антигена.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний, а также в судебно – медицинской экспертизе.

В санитарной практике с помощью этой реакции определяют фальсификацию пищевых продуктов.

Реакцию преципитации можно ставить не только в пробирках, но и в геле, а для тонких иммунологических исследований антигена применяется метод иммунофореза.

Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водо – растворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более плотный агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в различных участках геля, где и образуют линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Реакцию преципитации обычно ставят при комнатной температуре.

Широкое распространение при изучении антигенной структуры микробной клетки получил метод иммунофореза.

Комплекс антигенов помещают в луночку, находящуюся в центре агарового поля, залитого на пластину. Через агаровый гель пропускают электрический ток. Различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в результате действия тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластины, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген – антитело появляются линии преципитации.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.

При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция.

Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ дифтерийной антитоксической сыворотки - это то ее количество, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного экзотоксина. 1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина.

Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток - в геле (по Оухтерлони).

Реакция лизиса (РЛ)

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки является ее способность растворять микробы или клеточные элементы, поступающие в организм.

Специфические антитела, обуславливающие растворение (лизис) клеток, называются лизинами. В зависимости от характера антигена они могу быть бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами и др.

Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора – комплемента.

Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.

Комплемент – это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре.

Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.

Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.

Суть реакции бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими ей гомологичными живыми микробными клетками в присутствии комплемента происходит лизис микробов.

Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сывороткой (гемолитической) в присутствии комплемента, наблюдается растворение эритроцитов, т.е. гемолиз.

Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента «Борде – Жангу» и «Вассермана».

Титр комплемента – это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эту реакцию применяют при лабораторных исследованиях для обнаружения антител в сыворотке крови при различных инфекциях, а также для идентификации возбудителя по антигенной структуре.

Реакция связывания комплемента относится к сложным серологическим реакциям и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген». Комплекс «антитело – антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.

Адсорбция комплемента на комплексе «антиген – антитело» может по - разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.

Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева – Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения (реакции Борде – Жангу, Вассермана).

По механизму РСК протекает в две фазы:
а) Первая фаза – это образование комплекса «антиген – антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим.
б) Вторая фаза – это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым.

В случае, когда изменения антигена остаются недоступными для визуального наблюдения, приходится использовать вторую систему, выполняющую роль индикатора, позволяющую оценить состояние комплемента и сделать заключение о результате реакции.

Эта индикаторная система представлена компонентами реакции гемолиза, в составе которой находятся бараньи эритроциты и гемолитическая сыворотка, содержащая к эритроцитам специфические антитела (гемолизины), но не содержащая комплемент. Эта индикаторная система добавляется в пробирки через час после постановки основной РСК.

Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген – антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген – антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.

Реакция гемагглютинации (РГА)

В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

В одном случае реакция гемагглютинации относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения группы крови.

В другом случае реакция гемагглютинации не является серологической.

В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества (гемагглютинины), образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует куриные эритроциты, вирус полиомиелита – обезьяньи. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Учет результатов реакции осуществляется по расположению эритроцитов. При положительном результате эритроциты располагаются рыхло, выстилая дно пробирки в виде «перевернутого зонтика». При отрицательном результате эритроциты оседают на дно пробирки компактным осадком («пуговичка»).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации.

Высокая специфичность реакции торможения агглютинации позволяет с ее помощью определять вид, тип вирусов или выявлять специфические антитела в исследуемой сыворотке.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами, образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Сыворотки, обработанные флюорохромами, называются люминесцирующими.

Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры, т.к. микроорганизмы обнаруживются непосредственно в исследуемом материале. Результат можно получить через 30 минут после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки.

Реакцию иммунной флюоресценции применяют при ускоренной диагностике многих инфекций.

В лабораторной практике применяют два варианта реакции иммунофлюоресценции: прямой и непрямой.

Прямой метод – это когда антиген сразу обрабатывается иммунной флюоресцирующей сывороткой.

Непрямой метод иммунной флюоресценции заключатся в том, что изначально препарат обрабатывают обычной (не флюоресцирующей) иммунной диагностической сывороткой, специфической искомому антигену. Если в препарате имеется антиген специфический к данной диагностической сыворотке, то образуется комплекс «антиген – антитело», который увидеть нельзя. Если этот препарат дополнительно обработать лиминесцирующей сывороткой, содержащей специфические антитела к глобулинам сыворотки в комплексе «антиген – антитело», произойдет адсорбция люминесцирующих антител на глобулины диагностической сыворотки и как результат – в люминесцентный микроскоп можно увидеть светящиеся контуры микробной клетки.

Реакция иммобилизации (РИ)

Способность иммунной сыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизирующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях.

Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)

В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующим введением этой смеси в организм восприимчивых лабораторных животных или заражением культуры клеток. На основании выживания животных или отсутствия цитопатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител.

Эта реакция широко используется в вирусологии для определения вида или типа вирус и титра нейтрализующих антител.

К современным методам диагностики инфекционных заболеваний следует отнести иммунофлюоресцентный метод обнаружения антигенов и антител, радиоимунный, иммуноферментный метод, метод иммуноблоттинга, обнаружение антигенов и антител при помощи моноклональных антител, метод обнаружения антигенов при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР – диагностика) и др.

Заключающаяся во взаимодействии растворимого антигена с антителом с последующим выпадением мелкозернистого осадка (преципитата).

Реакция преципитации позволяет определить в исследуемом материале присутствие неизвестного антигена путем добавления известного антитела или при помощи известного антигена - неизвестное антитело. Преципитация идет хуже в отсутствие солей. Оптимум преципитации находится в диапазоне рН=7,0-7,4.

Механизм преципитации близок к механизму агглютинации. Под влиянием иммунной , прореагировавшей с антигеном, уменьшается степень его дисперсности. Необходимо, чтобы сыворотка и антиген были совершенно прозрачны. При постановке преципитации можно к одному разведению сыворотки добавлять разные разведения антигена либо наоборот.

Преципитация регистрируется лучше, если антиген наслаивать в пробирке на антитело. При этом наблюдается появление преципитата в виде кольца - кольцепреципитация. Кольцепреципитацию проводят в специальных пробирках диаметром 2,5-3,5 мм. Для определения числа антигенов в исследуемом материале или разных антител в сыворотке пользуются реакцией преципитации в агаре: 1% осветленный агар разливают в или на предметные стекла. В разные лунки, сделанные в агаре, наливают растворы антигена и антитела, которые диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации. Реакция преципитации широко используется при диагностике (см. Асколи реакция).

Преципитация в агаре позволяет определять токсигенность дифтерийных культур.

В судебно-медицинских исследованиях преципитация служит для установления видовой принадлежности крови, органов и тканей с помощью специфических преципитирующих сывороток.

Преципитация - реакция осаждения комплекса антигена (преципитиногена) и антитела (преципитина). Преципитация - один из иммунологических феноменов, позволяющих определить содержание антител (см.) в сыворотке крови больных или вакцинированных людей, а также в крови иммунизированных животных. При использовании стандартных сывороток реакция преципитации может быть применена для титрования различных по происхождению растворимых антигенов (см.).

При наиболее простой форме постановки реакции преципитации к ряду пробирок с постоянным количеством антигена добавляют подслаиванием исследуемую сыворотку в серии кратных разведений. После 30-60 мин. инкубации при комнатной температуре на границе двух жидкостей образуется кольцо помутнения - кольцепреципитация. Минимальное количество сыворотки, которое дает реакцию преципитации, принимают за титр антисыворотки. При обратной постановке реакции со стандартной антисывороткой удается оценить относительную концентрацию антигена в различных биологических жидкостях.

Результаты титрования антител и антигенов на основании вышеуказанного метода не имеют абсолютного количественного выражения. С целью количественной оценки содержания антител Гейдельбергер, Кабат (М. Heidelberger, Е. Kabat) и др. разработали количественный метод реакции преципитации, в основе которого лежит обнаружение так называемые зоны эквивалентности. При смешивании возрастных количеств антигена с постоянными объемами антисыворотки количество образующегося преципитата первоначально возрастает, а затем вновь снижается из-за увеличения растворимости комплекса антиген - антитело в избытке антигена. Если определить во всех пробирках содержание антител в надосадочной жидкости, то окажется, что в средних пробирках ряда или даже в единственной пробирке антител в надосадочной жидкости нет; вместе с тем здесь же образуется наибольший по величине преципитат. Поскольку в зоне эквивалентности в преципитат вовлекается также весь антиген, введенный в смесь реагирующих веществ, после вычитания из количества белка преципитата белка антигена получают точную величину содержания антител в данном объеме испытуемой сыворотки. Содержание белка преципитата после тщательного промывания охлажденным физиологическим раствором определяют по азоту или каким-либо колориметрическим методом.

При оценке значения реакции преципитации как диагностического метода необходимо учитывать, что в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела, не обладающие свойствами преципитинов и, следовательно, не образующие преципитата при взаимодействии с антигеном. К их числу относятся прежде всего неполные антитела, а также некоторые другие антитела, относящиеся к группе гамма-А-глобулинов.

Способность антисыворотки преципитировать антиген может быть нарушена нагреванием до 65-70°, обработкой органическими растворителями, восстановлением в кислой среде [Изликер (Н. Isliker), А.Я. Кульберг]. Феномен преципитации с антисывороткой, заведомо содержащей преципитины, возможен лишь при определенной температуре, концентрации солей и водородных ионов. Быстрее всего реакция преципитации протекает при 25-37°. Непременное условие образования преципитата - присутствие в изотонических концентрациях хлорида натрия (0,85% раствора NaCl). При увеличении концентрации NaCl до 15% преципитаты, образованные антигеном полисахаридной природы, частично растворяются, чем можно воспользоваться для извлечения чистых антител. Реакция преципитации с антигенами белковой природы протекает с одинаковой скоростью и полнотой как в 0,85%, так и в 15% растворах NaCl. Оптимальная для образования преципитата концентрация водородных ионов соответствует значениям рН от 5,0 до 9,0.

В лабораторной практике находят применение различные модификации реакции преципитации. В частности, реакцию термопреципитации применяют для обнаружения антигенов бактерий сибирской язвы, ботулизма и др., не подвергающихся термической денатурации (коктоантигены). Эта реакция отличается от реакции кольцепреципитации только тем, что в качестве антигена используют фильтрат прокипяченного исследуемого материала (см. А сколи реакция).

При анализе с помощью реакции преципитации сложной смеси антигенов невозможно охарактеризовать свойства отдельных компонентов смеси. Для решения этой задачи прибегают к методам преципитации в агаре и к иммуноэлектрофорезу. Метод преципитации в агаре в наиболее распространенной модификации Оухтерлоню (О. Ouchterlony) основал на том, что антиген и антисыворотка, диффундируя навстречу друг другу в тонком слое агара, образуют при встрече линии преципитации. По числу таких линий можно судить о количестве компонентов, содержащихся в данной смеси антигенов. Метод Оухгерлоню позволяет сравнивать различные антигенные смеси и определять степень родства присутствующих в них компонентов. При анализе сложной антигенной смеси, содержащей вещества с одинаковыми скоростями диффузии в агаре, большую помощь может принести метод иммуноэлектрофореза. Смесь антигенов предварительно разделяют в электрическом поле в пластинке агара, после чего проявляют отдельные компоненты антисывороткой. Антисыворотку вносят в ровик, проделанный в агаре параллельно линии, вдоль которой перемещались при электрофорезе антигены. Каждый из антигенов дает с антисывороткой индивидуальную дугу преципитации. Иммуноэлектрофорез широко применяют для анализа патологических отклонений в белках сывороток, а также при иммунологическом анализе тканевых и бактериальных антигенов.

Преципитация в судебно-медицинском отношении . Преципитация применяется в судебной медицине для установления видовой принадлежности крови, частей органов и тканей. В ряде следственных дел требуется установить видовую принадлежность крови, обнаруженной на орудиях совершения преступления, одежде преступника или жертвы и др. Для реакции преципитации применяют преципитирующие сыворотки, получаемые иммунизацией кроликов, петухов, коз белками разных животных. Обычно изготовляют сыворотки, преципитирующие белок человека, лошади, кошки, курицы, свиньи, собаки, рогатого скота. Они должны обладать титром не ниже 1:10 000 и быть достаточно специфичными. Из исследуемого пятна или корочки крови готовят вытяжки на физиологическом растворе, которые затем испытывают преципитирующими сыворотками. Вид белка считается установленным, если одна из преципитирующих сывороток образует преципитат с вытяжкой из исследуемой крови при соответствующей контрольной реакции. Реакцией преципитации можно установить также вид белка тканей и органов человека или животных. Обычно реакцию преципитации производят в пробирках с конусообразным концом. При получении мутных вытяжек реакцию преципитации производят в агаре по Оухтерлоню.

Особенность этой реакции в том, что взаимодействие антигена с антителом происходит в полутвёрдой среде - геле, чаще агаровом, иногда используют крахмальный гель, полиакриламидный и т. п.

Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри или на предметных стёклах. Ингредиенты реакции - антиген и антитела - помещают в лунки (колодцы), которые вырезают в агаре.

Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой (или радиальной) иммунодиффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной иммунодиффузии, когда и антиген, и антитело, помещённые в лунки, диффундируют навстречу друг другу в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации (кольцо из преципитата при простой иммунодиффузии и линии из преципитата - при двойной иммунодиффузии). В зависимости от сложности системы антиген - антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Чтобы установить титр преципитирующей сыворотки ставят реакции преципитации с различными разведениями антигена. То максимальное разведение антигена, дающее преципитацию с сывороткой, и является титром данной преципитирующей сыворотки.

Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, которая носит название реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Токсигенные культуры дифтерийных палочек, посеянные бляшками.

Нетоксигенные культуры, посеянные бляшками.

Фильтровальная бумага, пропитанная противодифтерийной сывороткой.

Линии из преципитата.

Агаровый гель.

Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакции преципитации. Смесь антигенов разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносится иммунная сыворотка, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии из преципитата.

С его помощью успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.

Реакции лизиса.

Для этого надо знать:

Иммунный лизис - это растворение клеток под при обязательном участии воздействием антител комплемента.

Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.

Иммунную сыворотку получают гипериммунизацией кролика соответствующим корпускулярным антигеном (микробные клетки, эритроциты и др.). Например, в реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (см. ниже) используется гемолитическая сыворотка, которую получают гипериммунизацией кролика эритроцитами барана; полученная таким образом сыворотка крови кролика содержит антитела (гемолизины) к эритроцитам барана. Таким образом получают и бактериолитические сыворотки, содержащие антитела, участвующие в лизисе бактерий.

3. Комплемент - термолабильный сложный комплекс белков сыворотки крови, при активации реагирующих между собой в определённой последовательности и образующих мембраноатакующий литический комплекс. В сыворотке комплемент находится в неактивном состоянии и активируется в момент образования комплекса антиген - антитело (адсорбируется на комплексе антиген - антитело). Комплемента много в свежей сыворотке морских свинок.

Из реакции лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и реже бактериолиза (главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).

Постановка реакции гемолиза .

Для постановки реакции гемолиза необходимы:

3 % взвесь эритроцитов барана на изотоническом растворе;

Стандартная гемолитическая сыворотка, приготовленная в производственных условиях и разведённая изотоническим раствором в 2 - 3 раза меньше, чем её титр (титр гемолитической сыворотки - то наибольшее разведение её, при котором происходит полный гемолиз 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента);

Комплемент, разведённый изотоническим раствором 1:10.

Если в пробирку поместить в определенных количественных соотношениях эритроциты барана (антиген), гемолитическую сыворотку (антитело) и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет изменение смеси: из темно-красной она становится розовой (лаковой) вследствие разрушения эритроцитов и выхода гемоглобина.

Реакция гемолиза обладает строго выраженной специфичностью. Ее используют в качестве индикатора для постановки реакции связывания комплемента.